100008, г. Караганда, ул. Гоголя 40
100008, Karaganda city, Gogolya str., 40
Айнұр Жаркынбекқызы Орынбасар
100008, г. Караганда, ул. Гоголя 40
Ainur Zharkynbekkyzy Orynbassar
100008, Karaganda city, Gogolya str., 40
100008, г. Караганда, ул. Гоголя 40
100008, Karaganda city, Gogolya str., 40
100008, г. Караганда, ул. Гоголя 40
100008, Karaganda city, Gogolya str., 40
100000, г. Караганда, ул. Ерубаева, 43
100000, Karaganda, Yerubayeva str., 43
Цель. Определение влияния малых интерферирующих РНК на экспрессию генов иммунного ответа в мононуклеарных клетках периферической крови у пациентов с ревматоидным артритом.
Материалы и методы. методом центрифугирования в градиенте плотности были получены мононуклеарные клетки периферической крови у пациентов с ревматоидным артритом. Введение миРНК (Silencer® Pre-designed siRNA, Ambion, by Life Technologies, USA) в мононуклеарные клетки периферической крови осуществлялось методом трансфекции с использованием коммерческих реагентов (липофектамин). Оценка экспрессии генов методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (ΔΔCt, log2 Fold Change) осуществлялась через 48 ч после нокдауна гена. Экспрессия GAPDH оценивалась в качестве эндогенного контроля. Статистическая обработка включала в себя непараметрический U-критерий Манна – Уитни (p=0,05).
Результаты и обсуждение. Результаты показали, что проведенная трансфекция полученных мононуклеарных клеток из периферической крови специфическими миРНК, направленными на гены INF-γ, IL-4, TLR4 и TLR7, снизила экспрессию TLR4 на 43,9% (p-value=0.0286), экспрессию TLR7 – на 38,4% (p-value=0.0211).
Заключение. Проведенное исследование подтвердило релевантность использования мононуклеарных клетках периферической крови как in vitro модели для изучения молекулярных механизмов, показав возможность воспроизведения особенностей иммунного ответа. Успешная трансфекция целевых миРНК, направленных на ключевые гены, продемонстрировала высокую точность и эффективность выбранного метода и привело к значительному снижению экспрессии.
Особенное внимание стоит уделить выявленной способности миРНК к эффективному подавлению экспрессии TLR4 и TLR7, это демонстрирует как работу самих миРНК, так и сам факт того, что исследуемые мишени чувствительны к сайленсингу. Снижение мРНК на этапе после транскрипции, имеет фундаментальное значение, выявляя TLR-рецепторы перспективными кандидатами для молекулярного вмешательства.
Aim. To determine the effect of small interfering RNAs on the expression of immune response genes in peripheral blood mononuclear cells of patients with rheumatoid arthritis.
Materials and methods. Peripheral blood mononuclear cells from patients with rheumatoid arthritis were isolated by density gradient centrifugation. Small interfering RNAs were introduced into peripheral blood mononuclear cells via transfection using commercial reagents (Lipofectamine). Gene expression was evaluated by real-time PCR (ΔΔCt, log₂ Fold Change) 48 hours after gene knockdown. GAPDH expression was used as an endogenous control. Statistical analysis included the nonparametric Mann – Whitney U test (p = 0.05).
Results and discussion. Transfection of peripheral blood mononuclear cells with specific small interfering RNAs targeting IFN-γ, IL-4, TLR4, and TLR7 resulted in 43,9% decrease in TLR4 expression (p=0.0286) and 38.4% decrease in TLR7 expression (p=0.0211).
Conclusion. The study confirmed the relevance of peripheral blood mononuclear cells using as an in vitro model for investigating molecular mechanisms, demonstrating their ability to reproduce features of the immune response. Successful transfection of target small interfering RNAs against key genes showed high precision and efficiency of the chosen method and led to a significant reduction in gene expression. Particular attention should be paid to the identified ability of small interfering RNAs to effectively suppress TLR4 and TLR7 expression, which demonstrates both the functionality of the small interfering RNAs and the susceptibility of these targets to silencing. Post-transcriptional reduction of mRNA levels is of fundamental importance, indicating that toll-like receptors are promising candidates for molecular intervention.
The authors declare that there are no conflicts of interest present.